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Appl Microbiol Biotechnol (2020) 83:233–239 BIOTECHNOLOGIE ET PRODUCTION DE MOLÉCULES D'INTÉRÊT Évaluation de l’activité biocide chez Rhizopus microsporus à travers sa production d’exométabolites et criblage de ses enzymes d’intérêts Garcia Quentin & Antoine Andjel Reçu: 23 March 2020 / Revu: 13 April 2020 / Accepté: 15 April 2020 Résumé R. microsporus appartient plus particulièrement à la Dans cette étude, nous avons identifié et étudié la souche famille des mucorales. Rhizopus microsporus afin de voir si il demeurait des activités biocides sur les souches Escherichia coli, Il s’agit d’un champignon phytopathogène qui infecte le Staphylococcus aureus, Candida albicans et maïs, le tournesol et le riz. Il peut également provoquer Cryptococcus neoformans. Dans un second temps, on a une infection nosocomiale et une nécrose de la zone cherché à cribler les activités enzymatiques (amylase, infectée, particulièrement fréquente chez les prématurés. lipase, laccase et protéase). Malheureusement, nous Ce champignon contient l'endosymbiote bactérien n’avons pu relever d’activité bactericide ou fongicide Burkholderia rhizoxinica qui produit la rhizoxine, un pour notre souche. Néanmoins, des activités médicament antitumoral. enzymatiques du type amylase, lipase et protéase ont pu être mis en évidence. Cette étude laisse envisager une possible utilisation de cette souche dans le milieu On peut donc se questionner sur sa capacité à produire médical et agroalimentaire. des métabolites d’intérêts ayant des activités antibiotique, antifongique ou encore même antiviral. Mots-clés Rhizopus microsporus • Lyase • Mucorales • natural products • antifungal • antibacterial Dans la littérature, très peu d’articles étudient les potentielles activités antibactériennes ou antifongiques 1. Introduction de R. Microsporus. Le monde fongique est un monde vaste, composé de Certains scientifiques se sont penchés sur sa capacité à nombreux taxons extrêmement diversifié possédant une produire une amylase (Vijayaraghavan. P et al . 2005), grande diversité d’espèces. Chacune d’entre elles d’autres sur la production de protéase (Sarao L. K et al possède des propriétés, des activités et des 2010), sur la production de lipase (Masumeh A. 2015) caractéristiques qui lui sont propres. De ce fait, chaque ou même sur une activité antifongique ciblée via des souche sera susceptible de présenter un intérêt bien chitinases produites par le champignon (Nam N. V. et al. spécifique lors de son utilisation dans les domaines 2007). pharmaceutique, environnemental et industriel. Dans le but d’accroître et diversifier l’utilisation de Néanmoins, nous allons cribler les exométabolites sources fongiques dans la production de molécules produits par notre champignon afin de déterminer s’il d’intérêt, des études sont réalisées sur un grand nombre demeure une activité antibiotique gram négatif (E. coli) d’espèces afin de comprendre le fonctionnement et les et/ou gram positif (S. aureus), une activité fongicide sur caractéristiques spécifiques de chacune d’entre elles. ascomycète (C. albicans) et/ou basidiomycète (Cr. neoformans). Nous avons décidé de nous concentrer sur le champignon Rhizopus microsporus, appartenant à la Une recherche sur le ciblage des enzymes division des zygomycètes. extracellulaires sera aussi réalisée pour observer les potentielles activités amylases, laccases, lipases et protéases de notre souche. Les zygomycètes sont proches des champignons supérieurs (ascomycètes), mais ils ne développent pas d'asques, mais de grosses spores à parois épaisses : les zygospores.On distingue trois classes de zygomycètes. neoformans incubée 48h à 26°C pour évaluer l’activité 2. Matériels et méthodes fongicide. 2.1 Présentation de la souche Le développement de ces cultures en présence des disques antibiotiques puis, la mesure de la zone d’inhibition de croissance permet l’analyse de l’activité Nous avons décidé de travailler sur la souche R. biocide de notre champignon sur ces 4 espèces. microsporus var. rhizopodiformis qui a pu être isolé puis identifié à partir des sols. La mesure (en mm) est réalisée 3 fois, une moyenne sera faite entre ces trois mesures, pour chaque disque 2.2 Mise en culture de la souche antibiotique. Une moyenne de la taille de la zone d’inhibition sera donc obtenue pour chacune des 3 L’organisme a été maintenu à 45°C sur des tranches espèces. d'aliments solides à base de farine d'avoine à 4 %. Après 2.5 Recherche d’une activité enzymatique avoir obtenu environ 3.105 spores/ml de cultures en 15 jours, on les a inoculés dans des flacons Erlenmeyer de Les activités enzymatiques (amylase, lipase, laccase et 125 ml contenant 80 ml de milieu liquide Carvalho protéases) vont être étudiées à partir de 40 mL de nos Peixoto (CP) : 0,8 % d'extrait de levure (p/v), 0,3 % de milieux de culture restants qui seront utilisés sans KH2PO4 (p/v) et 0,05 % de Mg2SO4Æ7H2O (p/v), 1,5 extraction du solvant. % d'amidon (p/v) ou une autre source de carbone, pH 6,0. Les cultures ont été incubées à 45°C, dans un Afin de déterminer l’activité amylase, deux tubes à essai agitateur rotatif à 100 tr/min pendant 72 h. sont préparés, le premier sert de témoin et contient 2mL d’amidon à 1 %, 2,5 mL de solution tampon (composée 2.3 Récupération du milieu de culture de 2,5 mL de solution de Na2HPO4 à 11,88 g/L et de 97,5 mL de solution de KH2PO4 à 9,08 g/L) et de 0,5 mL d’eau distillée. Le second tube contient 2mL Après une semaine, le contenu de l’erlenmeyer a été d’amidon à 1 %, 2,5 ml de solution tampon et 0,5 mL de filtré à l’aide d’une gaze afin de séparer le mycélium et milieu de culture des champignons. de récupérer seulement les 80 mL de milieu de culture Après avoir laissé les tubes 15 min dans une étuve, 1mL dans un nouvel erlenmeyer. Ces 80 mL de milieu de de réactif iodé-acide est ajouté. S’il n’y a pas d’activité culture obtenus ont été divisés dans deux tubes Falcon ; amylase, comme dans le tube témoin, la solution va être 40 mL servira à la recherche de l’activité biocide et 40 colorée en bleu foncé, en revanche, plus il y a d’amylase mL au criblage de l’activité enzymatique. et donc d’amidon dégradé, plus le contenu du tube sera clair et moins bleuté. 2.4 Recherche d’une activité biocide Concernant le criblage de l’activité protéase, nous allons Les métabolites totaux contenus dans les 40 mL de utiliser trois tubes à essai. Le premier contient 1 mL de milieu de culture précédemment récupérés sont extraits solution de caséine et 1 mL de solution tampon, il sera par extraction liquide-liquide. Le milieu de culture est notre témoin négatif. Le second 1ml de solution de placé dans une ampoule à décanter dans laquelle on caséine et 1 mL de notre milieu de culture. Le dernier effectue deux lavages successifs avec 40 mL d’acétate tube à essai contient 1 mL de solution de caséine et 1 mL d’éthyle. On récupère la phase organique où se trouvent de solution contenant une protéase à différentes les métabolites. La totalité de la phase organique est concentrations dans chaque tube, ils seront donc notre déposée dans un ballon ensuite placé dans l’évaporateur gamme étalon. Chaque tubes à essai vont être incubé à rotatif. Après le séchage, les métabolites sont 60° durant 10 min, la réaction sera ensuite arrêtée à resolubilisés dans 2 mL d’acétate d’éthyle puis placés l’aide de TCA (Acide trichloracétique). dans un tube à hémolyse. On centrifugera ensuite à 5000 tr /min pour séparer les précipités qui correspondent aux protéines dégradées, Les métabolites contenus dans ce tube sont ensuite des protéines entières présentent dans le surnageant. déposés sur quatre disques antibiotiques. Chaque disque Ainsi pour doser ses protéines nous utiliserons la est imbibé de 50 µL de métabolites avant d’être séché. méthode de Lowry (Lowry et al, 1951). Nous n’aurons Cette étape est réalisée quatre fois afin de concentrer les plus qu’à comparer la densité optique à 750 nm de notre métabolites dans le disque. second tube avec nos témoins ce qui nous permettra de déterminer s’il y a une activité protéolytique du milieu Quatre cultures ont été réalisées : une culture d’E. coli de culture et donc savoir s’il y a bien présence de sur gélose LB incubée 24h à 37°C et une culture de S. protéases. aureus sur gélose Chapman incubée 24h à 37°C pour évaluer l’activité antibactérienne. Puis une culture de C. Au niveau du criblage de l’activité lipase, nous allons albicans incubée 48h à 26°C et une culture Cr. utiliser un principe presque similaire au criblage de l’activité protéique. Ainsi nous utiliserons le même Discussion nombre de tubes mais nous remplacerons le 1 mL de solution de caséine par 1 mL de solution contenant du Au vu des résultats obtenus, on peut conclure sur le fait palmitate de 4-nitrophényle. que notre souche R. microsporus var. rhizopodiformis, Ce palmitate de 4-nitrophényle sera donc présent dans seule, n’aura pas forcément d’application quant à ces chaque tube et s’il y a activité enzymatique, la molécule effets biocides (par rapport à une activité antibiotique ou sera hydrolysée et donnera un produit de couleur jaune, antifongique) mais pourra être utile d’autres domaines le 4-nitrophénol, mesurable par spectrophotométrie à (industriel, médical, etc…). Néanmoins, on sait grâce 410 nm. Le premier tube contiendra en plus de cela 1 aux travaux de Claudia R. et al (2014) que Burkholderia mL de solution tampon, il sera notre témoin négatif. Le second, 1 mL de notre milieu de culture, et le dernier gladioli en coculture avec Rhizopus microsporus contiendra 1 mL de solution contenant une lipase, il sera permettrait la biosynthèse de polycétides antifongiques donc notre témoin positif. Nous allons alors comparer la et antibactériens. En plus de la production de la densité optique à 410 nm notre tube contenant le milieu rhizoxine, médicament antitumoral. de culture avec nos témoins ce qui nous permettra de savoir s’il y a bien présence de lipase. La production d’amylase pourrait être utilisée en industrie agroalimentaire (rendre les liquides fermentés Pour détecter l’activité laccase, nous réaliserons un plus clairs, éliminer et transformer l’amidon, ou Botrytest à l’aide d’un kit industriel. On va introduire accélérer la levée de la pâte à pain, etc…). Pour cela, il dans la seringue au moyen d’une pipette de 5 mL notre faudrait quantifier l’activité et probablement l’optimiser milieu de culture à tester. On va ensuite poser la pour son utilisation industrielle. seringue sur un tube Novotest et laisser percoler jusqu’à ce que la résine contenue dans la seringue soit mouillée En effet, on s’attendait à ces résultats car l’étude de jusqu’à la base pendant 10 minutes. Vijayaraghavan. P et al . (2005) évoquait déjà que R. On introduira ensuite le piston dans la seringue et on microsporus var. rhizopodiformis pourrait être considéré appuiera sur le piston dans la seringue légèrement et comme un producteur efficace d’amylases, utilisant des lentement. résidus bruts de faible coût comme substrats. On récoltera le premier millilitre (jusqu’à la première marque) dans le tube. On ajoutera 1.4 mL de tampon Cette découverte est très importante compte tenu de fournis dans le kit (jusqu’à la deuxième marque) puis 0.6 l'importance des amylases pour l'hydrolyse industrielle. mL de réactif « Botrytest laccase » (jusqu’à la troisième marque). On mélangera le tout en agitant le tube. La production de lipase aurait aussi un intérêt potentiel, Après trois minutes de repos, on pourra déterminer en effet les lipases forment une classe d’enzymes l’activité laccase en comparant la couleur développée hétérogènes de par leur origine, qu’elles soient animales, avec celle de l’échelle colorimétrique associée au kit végétales ou microbiennes, ce qui augmente encore leurs utilisé. potentialités. Toutes ces propriétés ont conduit au développement de nombreuses applications aussi bien au 3. Résultats point de vue industriel, notamment dans l’industrie agro- alimentaire et dans l’industrie chimique, qu’en médecine 3.1 Activité biocide humaine. Concernant les activités biocides, les résultats des Références antibiogrammes montrent une absence d’activité dirigée contre les bactéries et champignons testés dans notre Simone C. Peixoto Æ Joa ̃ o A. Jorge (2003) Rhizopus microsporus var. rhizopodiformis : a thermotolerant fungus étude. with potential for production of thermostable amylases 3.2 Activité enzymatique Claudia R. Viktoria O. (2014) Biosynthesis of anti fungal and antibacterial polypeptides by Burkholderia gladioli in Concernant les activités enzymatiques, on note la Coculture with Rhizopus microsporus présence d’activités amylase, lipase et protéase mais pas Jennifer. J Kristian Fog N. (2005) Secondary Metabolite and d’activité laccase notable pour notre souche. Mycotoxin Production by the Rhizopusmicrosporus Group Somayeh D. Grit W. (2013) Diversity and delimitation of Rhizopus microsporus Vijayaraghavan. P Remya C.S. (2011) Production of alpha- amylase by Rhizopus microsporus using Agricultural By- Products in Solid State Fermentation Nam N. V. K. Kim Y. J. (2007) Antifungal Activity of Chitinases from Trichoderma aureoviride DY-59 and Rhizopus microsporus VS-9 Sarao L. K. Arora M. (2010) Production Of Protease By Submerged Fermentation Using Rhizopus Microsporus Var Oligospous Masumeh A. (2015) Extraction of lipase from Rhizopus microsporus fermentation culture by aqueous two-phase partitioning T. Duriez-Vaucelle,J. Fargues,P. H. Robert & R. Popeye Etude enzymatique comparée de champignons entomopathogènes des gens Beauveria et Metarhizium