Equipamentos, vidraria, reagentes e soluÁıes Teoria e exercÌcios comentados Prof. Denise Rodrigues に Aula 00 Prof. Denise Rodrigues www.estrategiaconcursos.com.br 3 Equipamentos - IntroduÁ„o Grande parte dos equipamentos em um laboratÛrio È confeccionada em vidro, metal ou pl·stico e existem em diversos formatos e modelos. Muitos deles, como os microscÛpios e as centrÌfugas , necessitam de energia elÈtrica para o seu funcionamento. Os equipamentos utilizados nos laboratÛrios s„o os mais variados, mas, no geral, todos seguem algumas regras b·si cas para sua utilizaÁ„o: - O equipamento nunca deve ser usado para uma funÁ„o qu e n„o a sua ou fora de suas normas de utilizaÁ„o; - O equipamento nunca deve ser operado por uma pessoa co m d ̇vidas a respeito do seu funcionamento; - Sempre que for ligar o equipamento, deve-se observa r a voltagem correta de funcionamento. No caso de aparelhos bivolt, observar se existe chave para modificaÁ„o da voltagem ou se a modif icaÁ„o È autom·tica; - O uso de adaptadores e extensıes deve ser evitado; - No caso d e aquecimento e/ ou manuseio de lÌquidos, deve-se ter cuidado em evitar contato com as partes elÈtricas; - ApÛs a utilizaÁ„o, o equipamento deve ser deixado em condiÁıes ideais para sua melhor conservaÁ„o (desligar, limpar, fec har, cobrir, guardar e etc... ); A correta utilizaÁ„o e conservaÁ„o dos equipamentos de laboratÛrio È essencial para que o profissional possa obte r resultado s com qualidade. Em caso de d ̇vidas, sempre procurar o r espons·vel pelo laboratÛrio. Vamos agora iniciar o estudo sobre os principais equipam entos presentes em um laboratÛrio clÌnico: 0 PotenciÙmetro (pHmetro) O problema essencial da potenciometria È a determinaÁ„ o da concentraÁ„o de uma espÈcie iÙnica atravÈs da medida do po tencial. E o potenciÙmetro È o equipamento utilizado para mediÁ„o de pH (tambÈm chamado pHmetro, nesse caso È um eletrodo sensÌve l ao H + ) ou de outros Ìons seletivos em variadas amostras. Co nsiste em um eletrodo que È acoplado a um potenciÙmetro – aparelho que mede a diferenÁa de potencial. Ao ser submerso na amostr a, o eletrodo gera milivolts que s„o convertidos para uma es cala de pH. Em resumo, o pHmetro permite converter o valor de pot encial do eletrodo em unidades de pH, de 0 a 14. J· os eletrod os de Ìons seletivos s„o utilizados na determinaÁ„o do potencial de um Ìon especÌfico presente em uma soluÁ„o. S„o compostos por uma membrana sensÌvel a tal tipo de Ìon, que em contato com a amostra, indica a taxa de concentraÁ„o iÙnica. Dois modelos de pHmetro Autoclaves A autoclave È muito utilizada em laboratÛrios de pesq uisa e hospitais para a esterilizaÁ„o de materiais. O processo d e autoclavagem consiste em manter o material contaminado em contato com vapor de ·gua em temperatura elevada, sob press„o, por um perÌodo de tempo suficiente para matar todos o s micro- organismos Existem diferentes modelos, mas os componentes b·sicos de uma autoclave s„o : - Cilindro met·lico resistente, encontrado tanto na po siÁ„o horizontal, como na vertical (autoclaves horizontais x autoclaves verticais). Na maioria dos modelos de autoclave È nesse cilindro que se e ncontra a resistÍncia que realizar· o processo de aquecimento da ·gu a; - Tampa com parafusos de orelhas, que possibilita o fecham ento hermÈtico; - V·lvulas de ar e de seguranÁa; - Chave de comando, que possibilita ao operador contro lar a temperatura; - Registro indicador de press„o e temperatura. Modelo de autoclave do tipo vertical Estufas No laboratÛrio, a estufa È utilizada para criar um am biente contendo calor de maneira controlada em seu interior para que os conte ̇dos nela guardados sejam mantidos em uma temperatur a ideal, de acordo com o objetivo. Geralmente, a temper atura È mantida maior no seu interior do que externamente e s„o compostas de uma caixa e uma fonte de calor. Apresentam controle da temperatura atravÈs de termostato. A estufa È comumente utilizada para secagem de materia is (ex: vidraria), evaporaÁ„o lenta, cultivo de micro-organis mos , armazenagem de subst‚ncias lÌquidas em baixas temperaturas, esterilizaÁ„o e etc .. Vamos ver os diferentes tipos de estufa, de acordo com suas finalidades: Estufa de cultura ou bacteriolÛgica : utilizadas para incubaÁ„o de culturas bacteriolÛgicas ‡ temperatura constante (geralme nte 36,5∞C) por tempo vari·vel, para cultivo de micro- or ganismos. S„o estufas comuns nos laboratÛrios de pesquisa, laboratÛrios d e patologia clÌnica nos setor de microbiologia e etc. .. Estufa para esterilizaÁ„o (Forno de Pasteur) e secagem : s„o utilizadas em diversas ·reas para eliminar qualquer ag ente microbiolÛgico que possa estar nos instrumentos laboratori ais. Esterilizar os materiais de laboratÛrio È extremamen te importante para que n„o ofereÁam risco de contaminaÁ„o. Nesta estufa, utiliza- se a tÈcnica do calor seco, em alta temperatura. N„o deve ser utilizada para secagem de materiais volumÈtricos ou de ve ser utilizada de acordo com o limite de temperatura defin ido, pois o calor pode alterar a calibraÁ„o desses materiais MicroscÛpios Esse equipamento È um dos mais cobrados em provas de concurso! O microscÛpio È utilizado nos laboratÛrios para que se visualize cÈlulas e/ ou estruturas pequenas, sendo composto por dois sistemas de lentes. Tipos de microscÛpio Para cada tipo de an·lise temos um microscÛpio que melhor se encaixa. S„o classificados de acordo com o tipo de ilumin aÁ„o utilizada: 1) MicroscÛpio ”ptico ou Composto: a amostra È iluminada com uma fonte de luz. Estes microscÛpios apresentam dois sistemas/conjuntos de lentes, um nas oculares e outro nas objetivas. O sistema de lentes da objetiva È voltado para o objeto e forma no interior do aparelho a imagem do mesmo, e a ocular, que permite ao observador ver essa mesma imagem. A objetiva È forteme nte convergente e tem pequena dist‚ncia focal; j· a ocular È menos convergente que a objetiva. Esse microscÛpio È o mais a mplamente utilizado nos laboratÛrios clÌnicos Existem ainda subtipos de microscÛpios Ûpticos. Os mais comuns s„o : De campo claro: o objeto a ser analisado È visto contra um campo claro de exame. Adequados para visualizar amostras corada s como , por exemplo, esfregaÁos de sangue corados. De contraste de fase: È melhor para visualizar cÈlulas n„o coradas, que s„o quase sempre transparentes. Se adicionar um conde nsador de fase e objetivas especiais, o microscÛpio de campo claro pode se tornar um microscÛpio de contraste. Este microscÛpio È mu ito ̇til para amostras de sedimentos de urina e na contagem de plaquetas. De fluorescÍncia: usa luz ultravioleta para iluminar a amostra, permitindo que objetos corados com corantes fluorescentes se jam observados. Exemplo de aplicaÁ„o: detectar presenÁa de an ticorpos conjugados a fluorocromos e em an·lises de DNA. 2) MicroscÛpio EletrÙnico: utiliza um feixe de elÈtrons no lugar dos fÛtons utilizados em um microscÛpio Ûptico convencio nal Amplamente utilizado em pesquisa. Oferece ampliaÁ„o e poder de resoluÁ„o muito maiores que o microscÛpio Ûptico e, assim, objetos muito menores podem ser visualizados. Existem do is tipos de microscÛpios eletrÙnicos: MicroscÛpio EletrÙnico d e Transmiss„o (ME T) : possui sistemas de iluminaÁ„o e v·cuo que produz em feixes de elÈtrons de alta energia que, ao incidir sobre uma amostra de tecido ult rafina (na espessura de nanometro), fornecem imagens planas , imensamente ampliadas, possuindo a capacidade de aumento ̇til de atÈ um milh„o de vezes. Ass im , permit em a vis ua lizaÁ„o de molÈculas org‚nicas, como o DNA, RNA, algumas proteÌnas, etc. A interaÁ„o dos elÈtrons transmitidos atravÈs da amostra for ma uma imagem que È ampliada e focada em um dispositivo de i magem, como uma tela fosforescente e visualizada com um vidro d e proteÁ„o, ou È projetada em um monitor. MicroscÛpio EletrÙnico de Varredura: o feixe de elÈtrons realiza uma espécie de varredura, um “ escanea mento” da superfÌcie da amostra revestida por metal e È gera da uma imagem tridimensional CentrÌfug as Equipamento que gira em alta velocidade, fazendo com que a substância mais densa seja “forçada” a sedimen tar (decantar) devido a aÁ„o da forÁa centrÌfuga. Existem alguns tipos de cent rÌfuga: Micro hematÛcrito: para hematÛcrito pelo sistema de tubos capilares e leitura por rÈgua. Macro centrÌfuga: para separaÁ„o de fases de diferentes densidades em subst‚ncias lÌquidas em tubos. Micro centrÌfuga: para centrifugaÁ„o de microtubos. CentrÌfuga para microplaca: centrifugar microplacas de testes. UltracentrÌfuga : tipo especÌfico de centrÌfuga necess·rio para realizar a ultracentrifugaÁ„o. As velocidades alcanÁadas p elos rotores nestas centrÌfugas s„o muito elevadas, obtendo-se aceleraÁı es atÈ 500 000 g. Neste tipo de centrÌfuga, a c‚mara onde se situ a o rotor È refrigerada e encontra-se sob v·cuo, para evitar o supe raquecimento por atrito com o ar e assim para permitir que altas ve locidades sejam atingidas. Modelos de CentrÌfugas EspectrofotÙmetro Equipamento amplamente utilizado nas ·reas de bioquÌ mica e biologia molecular no s laboratÛrios de an·lises clÌnicas e quÌmica , dentre outros. Tem a funÁ„o de medir e comparar a quan tidade de luz (energia radiante) absorvida por uma determinada soluÁ„o. Ou seja, È usado para medir (identificar e determinar) a concentraÁ„o de subst‚ncias que absorvem energia radiante, em um solven te. Modelos de EspectrofotÙmetros Analisadores automatizados Leitores de Elisa O termo ELISA vem da sigla em inglÍs para Enzyme Linked Immunosorbent Assay . Trata-se de tÈcnica imunoenzim·tica (e nsaio imunoenzim·tico ou enzimaimunoensaio ), termo genÈrico para um grande n ̇mero de testes que permitem ensaios quali- e quantitativos, para a detecÁ„o tanto de antÌgenos quant o de anticorpos em amostras biolÛgicas. Os ensaios imunoenzim· ticos tem como princÌpio uma interaÁ„o prim·ria entre Ag-Ac que È visualizada devido aÁ„o de uma enzima sobre seu substrato e formaÁ„o de produto sol ̇vel colorido, cuja determinaÁ„o È feita med indo-se a densidade Ûtica da soluÁ„o por espectrofotometria O leitor de ELISA È o equipamento de escolha para leitura espectrof otomÈtrica ao final da tÈcnica de ELISA devido a algumas vantage ns. Exemplo de Equipamentos - ELISA