Capitolo 12 Consegna di nanoparticelle superparamagnetiche del vaccino a DNA Fatin Nawwab Al-Deen, Cordelia Selomulya, Charles Ma e Ross L. Coppel Astratto L'efficienza della somministrazione dei vaccini a DNA è spesso relativamente bassa rispetto ai vaccini proteici. L'uso di nanoparticelle di ossido di ferro superparamagnetico (SPION) per fornire geni tramite magnetofezione mostra risultati promettenti nel migliorare l'efficienza della consegna genica sia in vitro che in vivo. In particolare, la durata della trasfezione genica, specialmente per l'applicazione in vitro, può essere significativamente ridotta dalla magnetofezione rispetto al tempo necessario per ottenere un'elevata trasfezione genica con protocolli standard. Le SPION che sono state rese stabili in condizioni fisiologiche possono essere utilizzate sia come agenti terapeutici che diagnostici grazie alle loro caratteristiche magnetiche uniche. Le preziose caratteristiche delle nanoparticelle di ossido di ferro nelle bioapplicazioni includono uno stretto controllo sulla loro distribuzione dimensionale, le proprietà magnetiche di queste particelle, e la capacità di trasportare particolari biomolecole verso obiettivi specifici. L'interiorizzazione e l'emivita delle particelle all'interno del corpo dipendono dal metodo di sintesi. Numerosi metodi di sintesi sono stati utilizzati per produrre nanoparticelle magnetiche per bioapplicazioni con diverse dimensioni e cariche superficiali. Il metodo più comune per sintetizzando magnetite Fe . di dimensioni nanometriche3oh4 particelle in soluzione avviene per coprecipitazione chimica dei sali di ferro. Il metodo della coprecipitazione è una tecnica efficace per preparare dispersioni acquose stabili di nanoparticelle di ossido di ferro. Descriviamo la produzione di Fe3oh4-a base SPION con elevati valori di magnetizzazione (70 emu/g) al di sotto di 15 kOe del campo magnetico applicato a temperatura ambiente, con 0,01 emu/g rimanenza mediante un metodo di coprecipitazione in presenza di citrato trisodico come stabilizzante. Le SPION nude spesso mancano di sufficiente stabilità, idrofilia e capacità di essere funzionalizzate. Per superare queste limitazioni, il polimero policationico è stato ancorato sulla superficie di SPION appena preparati mediante un'attrazione elettrostatica diretta tra gli SPION caricati negativamente (a causa della presenza di gruppi carbossilici) e il polimero caricato positivamente. La polietilenimina è stata scelta per modificare la superficie delle SPION per favorire il rilascio di DNA plasmidico nelle cellule di mammifero grazie all'ampia capacità tampone del polimero attraverso l'effetto "spugna protonica". Parole chiave Nanoparticelle di ossido di ferro superparamagnetico, SPION, Polietilenimina, PEI, vaccino DNA, Magnetofezione 1. Introduzione Le nanoparticelle di ossido di ferro superparamagnetico (SPION) hanno attirato un'attenzione significativa nelle applicazioni di consegna genica a causa della loro tossicità relativamente bassa, del basso costo di produzione, Monica Rinaldi et al. (ed.),Vaccini DNA: metodi e protocolli, Metodi in biologia molecolare, vol. 1143, DOI 10.1007/978-1-4939-0410-5_12, © Springer Science+Business Media New York 2014 181 182 Fatin Nawwab Al-Deen et al. capacità di immobilizzare materiali biologici sulle loro superfici e potenziale per il targeting diretto utilizzando magneti esterni. È stato dimostrato che il rilascio genico assistito da particelle magnetiche, noto anche come trasfezione magnetica o magnetofezione, migliora sia l'efficienza del rilascio genico che la rapidità di assorbimento in diversi tessuti in vitro.1]. La magnetofezione ha avuto origine dal concetto di somministrazione magnetica di farmaci alla fine degli anni '70, con la tecnica che dimostra l'applicabilità alla somministrazione di geni con vettori virali e non virali.2]. Le particelle magnetiche sembrano essere generalmente utilizzabili con qualsiasi vettore di consegna genica e la durata del processo di trasfezione può essere significativamente ridotta fino a 10 minuti, rispetto all'incubazione di 4 ore usuale con i protocolli standard [2]. La magnetofezione è uno strumento appropriato per la trasfezione genica rapida e specifica che richiede solo basse dosi in vitro e consente applicazioni in vivo site-specific [3, 4]. Nella biotecnologia, le caratteristiche critiche delle nanoparticelle magnetiche sono le loro dimensioni su scala nanometrica, le proprietà magnetiche e la capacità di legare particolari biomolecole e consegnarle a bersagli specifici. Gli studi effettuati nell'ultimo decennio hanno utilizzato diversi tipi di ossidi di ferro, tra cui maghemite, -Fe2oh3, o magnetite, Fe3oh4, che consistono in un unico dominio di circa 5-20 nm di diametro [5, 6]. Magnetite, Fe3oh4, è il più comune candidato all'ossido di ferro magnetico perché la sua bio- la compatibilità nei sistemi biologici è già stata dimostrata [7]. Questa forma di ossido di ferro è stabile in acqua o soluzione salina fisiologica in condizioni di pH neutro. Ha un'ampia superficie che può essere modificata per attaccare agenti biologici [8]. Le nanoparticelle di questa composizione con materiali di rivestimento superficiale adatti possono disperdersi ampiamente in solventi adatti per produrre una sospensione omogenea chiamata ferrofluido che consente un'ulteriore funzionalizzazione biochimica. Numerosi metodi di sintesi sono stati utilizzati per produrre nanoparticelle magnetiche per bioapplicazioni, tra cui coprecipitazione, microemulsioni, polioli, sintesi sol-gel, sintesi sonochimica, idrotermale, idrolisi, termolisi di precursori organici, iniezione di flusso ed elettrospray [5, 9]. Questi metodi sono stati utilizzati per preparare particelle magnetiche con composizione omogenea e distribuzione granulometrica ristretta. Tuttavia, il metodo più comune per sintetizzare particelle di magnetite in soluzione nell'intervallo nanometrico è la coprecipitazione chimica dei sali di ferro. La tecnica è probabilmente la via chimica umida più semplice ed efficiente per ottenere particelle magnetiche per applicazioni biomediche [10]. La stabilizzazione delle nanoparticelle di ossido di ferro è una caratteristica importante per ottenere colloidi ferrofluidi che non si aggregano sia nei mezzi biologici che nel campo magnetico. La superficie idrofoba delle particelle magnetiche significa che in assenza di rivestimento Consegna di nanoparticelle superparamagnetiche del vaccino a DNA 183 materiali, queste particelle tendono ad interagire tra loro per formare grandi ammassi, con conseguente aumento della dimensione aggregata [ 10]. Gli strati di rivestimento non solo forniscono stabilità alle nanoparticelle in soluzione, ma aiutano anche a legare vari ligandi biologici alla superficie delle particelle per varie applicazioni biomediche. Vari materiali sono stati utilizzati come rivestimenti protettivi per nanoparticelle magnetiche. La polietilenimmina (PEI) è uno dei composti cationici più efficienti per la veicolazione del DNA plasmidico nelle cellule dei mammiferi grazie alla sua ampia capacità tampone attraverso gli effetti "spugna protonica" [ 11, 12]. È noto che il polimero PEI forma complessi cationici con le SPION che poi interagiscono in modo non specifico con il DNA caricato negativamente ed entrano nella cellula tramite endocitosi.13]. A differenza di altri polimeri cationici, il PEI ha un'elevata efficienza di trasfezione anche in assenza di agenti endosomolitici come i peptidi fusogenici o la clorochina che facilita l'assorbimento cellulare [14]. Molti tipi di collegamenti sono stati utilizzati per accoppiare nanoparticelle magnetiche ad acidi nucleici e il più semplice è un metodo fisico basato sull'interazione elettrostatica tra particelle magnetiche caricate positivamente con uno strato di rivestimento di polimero cationico e acidi nucleici caricati negativamente. Diversi fattori sono stati esaminati per i loro effetti sulla preparazione del complesso di geni magnetici come il peso molecolare e le diverse strutture (struttura ramificata e lineare) del PEI, nonché la densità di carica e il rapporto carica-massa del polimero e delle molecole di DNA [13]. Ad esempio, il nostro lavoro precedente ha mostrato che SPION/complessi PEI ramificati a pH 4.0 hanno mostrato una migliore capacità di legame per il DNA rispetto a un pH neutro, nonostante differenze trascurabili nelle dimensioni e nella carica superficiale dei complessi [15]. Questa scoperta potrebbe essere il risultato della protonazione e della repulsione della carica reciproca tra i gruppi amminici PEI in condizioni acide, espandendo la rete polimerica per aumentare la quantità di materiale genetico intrappolato e di conseguenza aumentando l'espressione genica dopo l'iniezione. Al contrario, la struttura rigida e stabile degli anelli a sei membri del polimero in condizioni neutre diminuirebbe la capacità della particella di intrappolare più molecole di DNA, diminuendo successivamente il dosaggio del DNA (vedere Fico. 1) [15]. In questo capitolo, descriviamo un metodo di coprecipitazione per produrre SPION. Questo metodo è eccezionalmente utile in quanto è in grado di produrre particelle magnetiche di una dimensione specifica nell'intervallo nanometrico e con buone proprietà magnetiche. Le particelle prodotte possono quindi essere rivestite con polimeri PEI come esempio di polimeri cationici utili che possono formare complessi con molecole di DNA per la consegna genica. 184 Fatin Nawwab Al-Deen et al. Legami di idrogeno + H2N H2N + NH + NH NH2 H H N+ H H2N + + H 2N no NH + + H NH2 no HN H3C H H NH + H2N H2N no H + H H+ HN H2N + + NH H + HN no + HN HN+ no NH2 + no + NH H H2N + H H NH NH H2N noH2 NH + H no NH NH NH no NH2 NH NH + + NH H NH NH no no NH + + no + + + H H NH NH HN+ HN 2 H2N H H NH HN + 2+ HN + H2N + no + HN H2N NH2 + H NH NH2 NH + NH2 + H 2N + NH no no OH- NH Fe3oh H3C NH + H+ no NH2 H NH H2N no + H2N + + H + 2N H NH + + Fe3O4 H2N HN no NH NH2 4 NH 2 + NH NH + no + NH NH NH + NH no no NH+ H H2N + NH + H 2+N H + H2N+ NH no NH + NH NH + + NH2 H2N + + + HN H2no H 2N no H2N no + NH2 NH NH + NH + + + + + H no H H 2N NH H +NH NH H+ + no NH2 + NH NH NH NH + no + NH H NH NH HN H2N NH2 H H NH2 + + H2N no H+2N H NH + 2N + NH2 H HNH + no no NH + NH H2N NH + NH + NH 2 H + H no H NH + NH NH H2N H2N + H 2N H NH H no NH + + HN NH2 no NH + CH3 NH H + NH2 + + H no + NH + H no H NH NH H no NH H NH + + no HN + NH H no + H NH + H N+H no + NH2 H no NH2 H NH2 + NH 2 + + NH + + H2N Condizione di pH acido Condizione di pH neutro DNA Fe3oh4 Fe3oh4 Fig. 1 Uno schema che mostra le strutture PEI in condizioni di pH acido e neutro, che mostra una struttura relativamente ramificata a causa della repulsione della carica reciproca tra i gruppi amminici in condizioni acide e una struttura rigida in condizioni di pH neutro, con il DNA che è probabile che venga intrappolato nelle rispettive strutture. Adattato da Al-Deen et al. [15], con il permesso delle pubblicazioni dell'American Chemical Society (ACS) di Langmuir 2 materiali Preparare tutte le soluzioni utilizzando acqua ultrapura (preparata purificando acqua deionizzata dd H2O per ottenere una sensibilità di 18 MΩ cm a 25 °C) e reagenti di grado analitico. Preparare e conservare tutti i reagenti a temperatura ambiente (salvo diversa indicazione). 2.1 Ossido di ferro 1. Fe (III) cloruro (FeCl3.6H2O) e Fe (II) cloruro Nano particella (FeCl2.7H2O) (rispettivamente da Ajax Finechem e Ajax Preparazione da Ferro Chemicals). Sali Consegna di nanoparticelle superparamagnetiche del vaccino a DNA 185 2. Citrato trisodico diidrato (C6H5N / A3oh7. 2H2O) (Sigma Aldrich). 3. Reagente ACS idrossido di sodio, ≥97,0 % in pellet (Sigma Aldrich). 4. Olio da cucina per bagno d'olio. 5. Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments Ltd., Regno Unito). 6. Diffrattometro 1140 PW con Cu K . filtrato al nichelα radiazione (=1.5405 ) (Philips). 7. Magnetometro a campione vibrante (VSM) (Riken Denshi). 8. Microscopio elettronico a trasmissione (TEM) CM20 (Philips). 3 complessi SPION / PEI 1. Soluzione PEI: 10 % PEI in acqua (p/v), pH 7,9. Pesare 10 g di PEI (peso molecolare 25 kDa ramificato, Sigma Aldrich) e sciogliere in 75 ml di H2O. Regolare il pH a 7,9 con HCL concentrato e aggiungere acqua fino a un volume di 100 ml. Filtra il Soluzione PEI attraverso un 0,22 μfiltro nitrocellulosa m. Conservare la soluzione a 4 °C (vedere Nota 1). 2. HC1 0,5 M. 3. NaOH 0,5 M. 4. Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments Ltd., Regno Unito). 5. Tubo per dialisi Spectra/Por® membrane (MWCO=12.000– 14.000) (Spectrum Medical Industries, Inc., Los Angeles, CA). 3.1 SPION/PEI/DNA 1. DNA plasmidico privo di endotossine: 10 μg/ml. poliplessi 2. 1 × PBS, pH 7,4. 3.2 Gel di agarosio 1. Agarosio. Elettroforesi 2. 6 × Tampone di caricamento del campione: pesare ~ 0,05 mg di bromofenolo blu e trasferire in una provetta da 2 ml con 1 ml di H . sterile2O e 1 ml di glicerolo. Aggiungere abbastanza blu di bromofenolo per fare il tampone blu profondo. Per la conservazione a lungo termine, mantenere congelato il tampone di caricamento del campione. 3. Soluzione madre di bromuro di etidio (EtBr) (10 mg/ml): 0,02 g in 1 ml di H . sterile2O. 4. Standard della scala del DNA. 5. Tampone tris–acetato–EDTA (TAE) 50×: 242 g di base tris, 100 ml di soluzione 0,5 M EDTA, 57,1 ml di acido acetico glaciale, pH 8,5. Aggiungere 800 ml di acqua in un cilindro graduato da 1 l. Pesare 242 g di base tris e trasferire nel cilindro. Aggiungere 100 ml di EDTA 0,5 M e 57,1 ml di acido acetico glaciale, mescolare e regolare il pH a 8,5 186 Fatin Nawwab Al-Deen et al. usando KOH. Aggiungere fino a 1 l con H2O. Conservare il tampone a temperatura ambiente (vedere Nota 2). 6. Camera di elettroforesi. 7. Alimentazione. 8. Vassoio e pettini per colata di gel. 3.3 Sistema di riflusso 1. Pallone a tre colli da 100 ml. 2. Imbuto di caduta. 3. Pompa a vuoto per l'evacuazione dell'aria. 4. Bagno ad ultrasuoni (Power Sonic 405, 40 kHz e 350 W). 5. Sonicatore sonda (cella Vibra Sonics, 40 kHz e 130 W). 6. N2 cilindro del gas. 7. Condensatore raffreddato ad acqua. 8. Regolatore di temperatura. 9. Agitatore magnetico riscaldante. 10. Barra di agitazione. 4 metodi 4.1 Sintesi Questo metodo prevede la coprecipitazione di sali ferrosi e ferrici in una e caratterizzazione soluzione alcalina mediante l'aggiunta di una base come il concentrato di SPION idrossido di ammonio (NH4OH) o idrossido di sodio (NaOH) in ambiente non ossidante (N2 atmosfera gassosa) con la seguente reazione chimica [16, 17]: Fe2+ + 2Fe3+ + 8OH- ® Fe3oh4 + 4H2O. Il controllo sulle dimensioni e sulla forma delle nanoparticelle dipende dal Fe2+ e Fe3+ rapporto, il tipo di sali (es. solfato, nitrato, cloruro) e il pH del mezzo di reazione [10]. 1. Pesare 1,35 g (0,005 mol) di Fe (III) cloruro (FeCl3.6H20) e 0,70 g (0,0025 moli) di Fe(II) cloruro (FeCl2.7H2o) diidrato (rapporti 1:2 M), e scioglierli in 20 ml di H2O nel primo bicchiere [1]. 2. Pesare 1,2 g (1,5 mol) di NaOH e 1,47 g (0,005 mol) di citrato trisodico diidrato e scioglierli in 20 ml di Milli-Q H2O nel secondo bicchiere [2] (vedere Nota 3). 3. Sonicare questi becher in un bagno a ultrasuoni con la velocità di agitazione di omogeneizzazione (3.600–9.000 rpm) per 10–15 min. 4. Trasferire la soluzione nel primo becher [1] in un matraccio a tre colli da 100 ml e posizionare una piccola barra magnetica all'interno del matraccio. Mettere la beuta nel bagno d'olio già posizionato sull'agitatore magnetico e impostare la velocità di agitazione a 1.000– 1.500 giri (vedere Nota 4). Riscaldare il bagno d'olio a 80 °C (vedere Fico. 2). Consegna di nanoparticelle superparamagnetiche del vaccino a DNA 187 D E Acqua fuori Gas C N2 Sistema di raffreddamento 2 3 1 Acqua in Olio B UN Fig. 2 Un sistema a reflusso per la sintesi di nanoparticelle di ossido di ferro superparamagnetiche (SPION). (UN) Agitatore magnetico riscaldante, (B) regolatore di temperatura, (C) condensatore raffreddato ad acqua, (D) condensatore raffreddato ad acqua, (E) pompa per vuoto di evacuazione dell'aria 188 Fatin Nawwab Al-Deen et al. 5. Trasferire la soluzione nel secondo becher [2] in un imbuto gocciolatore e collegare l'imbuto con il pallone a fondo tondo a tre colli tramite il collo [2]; assicurarsi che il suo rubinetto sia chiuso (vedere Nota 5) (vedere Fico. 2). 6. Introdurre un tubo separato del flusso di azoto nel pallone a fondo tondo a tre colli attraverso il collo 3 (vedere Fico. 2). Tubo separato collegato al condensatore che è stato collegato alla bombola del gas N2 tramite un sifone collegato alla parte superiore del condensatore. 7. Collegare il condensatore raffreddato ad acqua al pallone a tre colli tramite il collo 1 (vedere Fico. 2) (vedere Nota 6). Avviare la circolazione dell'acqua aprendo un rubinetto. Assicurarsi che l'acqua fredda scorra attraverso il condensatore con portate d'acqua moderate. 8. Avvolgere tra loro i collegamenti delle apparecchiature nel sistema di riflusso con una sottile striscia di pellicola di paraffina per evitare che l'aria esterna entri nel sistema. 9. Rimuovere l'aria dal sistema utilizzando una pompa a vuoto per 4-5 minuti Aprire con cautela il rubinetto della bombola per consentire N2 gas per entrare nel sistema per 4-5 minuti a una velocità costante ma controllata fino a 18,2 g per fornire un mantello di azoto alla reazione. N fluente2 il gas attraverso il mezzo di reazione durante la reazione di sintesi può fornire protezione al ferro prodotto particelle di ossido da ossidazione. Il pallone a tre colli è mantenuto sotto una pressione positiva di azoto per mezzo di una disposizione a trappola per gas collegata alla sommità del condensatore. 10. Quando la temperatura del sistema raggiunge 80 ° C, ruotare parzialmente il rubinetto dell'imbuto per avviare la coprecipitazione acquosa della soluzione di sale di ferro con NaOH e soluzione di citrato trisodico diidrato. 11. Dopo 1 h di reazione, raccogliere i precipitati neri risultanti e rimuoverli dalla soluzione applicando un mag- netto. Quindi lavare i precipitati quattro volte, prima con ddH2O, poi due volte con etanolo e infine con acqua deionizzata (DI) per rimuovere ioni e sali in eccesso dalla sospensione. La concentrazione della soluzione sarà di circa 8 mg/ml. 12. Disperdere il precipitato lavato in 20 ml di acqua deionizzata. Zetasizer Nano ZS viene utilizzato per determinare il diametro idrodinamico e il potenziale zeta di queste particelle in sospensione, mentre TEM CM20 viene utilizzato per confermare la dimensione e la morfologia delle particelle secche. Diffrazione di raggi X su polvere (XRD), mediante diffrattometro con Cu K filtrato al nichelα radiazione (=1.5405 UN), viene utilizzato per determinare la cristallinità e la fase delle particelle di ossido di ferro. La saturazione magnetica viene misurata utilizzando un VSM sotto un campo magnetico fino a 15 kOe a temperatura ambiente. Consegna di nanoparticelle superparamagnetiche del vaccino a DNA 189 un b 80 60 40 20 M(emu/g) 0 - 20000 - 10000 0 10000 20000 - 20 - 40 - 60 Campo applicato /kOe 20 nm - 80 Fig.3 (a) Un'immagine TEM di SPION sintetizzate, (b) Dati VSM per SPION, con X- e Y-assi nel grafico che indicano rispettivamente il campo applicato (kOe) e la magnetizzazione (emu/g) Un esempio di dimensione e morfologia delle SPION preparate sotto TEM e saturazione magnetica utilizzando un VSM è mostrato in Fig. 3. 4.2 Rivestire SPION Nella magnetofezione, le nanoparticelle magnetiche necessitano di con polimero PEI rivestimenti superficiali appropriati per formare complessi genici, che aumentano anche la loro stabilità in soluzione. La stabilità delle nanoparticelle magnetiche nel fluido biologico può essere migliorata modificando la loro superficie utilizzando materiali inclusi materiali inorganici e polimerici per aumentare le forze repulsive tra le particelle, bilanciando così le forze magnetiche e attrattive di van der Waals [18] (vedere Nota 7). 1. Mescolare la sospensione di ossido di ferro preparata (0,1 mg/ml) con una soluzione di PEI al 10% (p/v) (PEI ramificato da 25 kDa), a rapporti di massa PEI/Fe di (R)=10, durante la sonicazione utilizzando un sonicatore a sonda utilizzando un apparato Sonic vibra cell 130 W a 40 kHz per 5 min. 2. Dializzare i complessi SPION/PEI prodotti utilizzando membrane Spectra/Por (MWCO=12.000–14.000) contro acqua deionizzata per 3 giorni per rimuovere qualsiasi PEI non legato/in eccesso. 3. Acidificare la miscela di complesso SPION/PEI a pH 2.0 usando 0,5 M HCl e mantenere a questo pH per 10 min per stabilizzare i complessi. 4. Dividere ogni campione in due aliquote: aumentare il pH della prima parte a 4.0 (denominato SPION/PEI-A), mentre l'altra parte viene neutralizzata a pH 7.0 (denominato SPION/PEI-N) usando 0,5 M NaOH. 190 Fatin Nawwab Al-Deen et al. Fig. 4 Immagini TEM di (un) SPION come sintetizzati e (b) SPION / PEI (rapporto = 10) a pH 4 che mostrano una migliore dispersione. Adattato da Al-Deen et al. [15], con il permesso delle pubblicazioni dell'American Chemical Society (ACS) di Langmuir Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments Ltd., UK) viene utilizzato per determinare il diametro idrodinamico e il potenziale zeta di SPION/PEI in sospensione, mentre TEM CM20 viene utilizzato per confermare la dimensione e la morfologia delle particelle secche. Un esempio della piccola dimensione aggregata delle SPION/PEI preparate a pH 4.0 rispetto alle SPION nude sotto TEM è mostrato in Fig.4. 4.3 Preparazione di 1. Mescolare il DNA plasmidico ad una concentrazione di 10 μg/ml in PBS (pH SPION/PEI/DNA 7.4) con complessi SPION / PEI a R di 10 a diversi rapporti N / poliplessi P (cioè il rapporto molare tra azoto PEI e fosfato di DNA) ( vedere Nota 8 per i dettagli sul calcolo dei diversi rapporti N/ P). 4.4 DNA Le capacità di legame al DNA dei poliplessi SPION/PEI/DNA sono Saggio di ritardo determinate utilizzando l'elettroforesi su gel di agarosio all'1%. I complessi SPION/PEI con DNA plasmidico si sono formati a rapporti N/P di 0,5-30. 4.5 Gel di agarosio 1. Misurare 1 g di agarosio. Elettroforesi di 2. Versare la polvere di agarosio nel pallone insieme a 100 ml di 1×TAE. SPION/PEI/DNA 3. Far bollire agitando la soluzione di agarosio su un fornello (fino a poliplessi quando tutte le piccole particelle di agarosio traslucide si sono dissolte, la soluzione diventa limpida e c'è un bel bollore) (circa 10 min). 4. Lasciare raffreddare la soluzione di agarosio a circa 50–55 °C, agitando di tanto in tanto il pallone per raffreddare regolarmente. Consegna di nanoparticelle superparamagnetiche del vaccino a DNA 191 5. Aggiungere EtBr a una concentrazione finale di circa 0,5 μg / ml (di solito circa 2-3 μl di soluzione madre per 100 ml di gel) ( vedere Nota 9). 6. Sigillare le estremità del vassoio di colata con due strati di nastro adesivo. 7. Posizionare i pettini nel vassoio di colata di gel. 8. Versare la soluzione di agarosio fusa nel vassoio di colata e lasciare raffreddare fino a quando non è solida. 9. Estrarre con attenzione i pettini e rimuovere il nastro. Mettere il gel nella camera di elettroforesi. 10. Aggiungere abbastanza tampone TAE in modo che ci siano circa 2-3 mm di tampone sul gel (vedere Nota 10). 4.6 Caricamento del gel 1. Per ogni rapporto N/P, mescolare la quantità appropriata di SPION/PEI con 0,5 μg DNA plasmidico nel 25 μl PBS. 2. Incubare tutte le soluzioni polyplex SPION/PEI/DNA a 37 °C per 30 min. 3. Aggiungi 5–6 μl di 6× tampone di caricamento del campione a ogni 25 μl Poliplessi SPION/PEI/DNA. 4. Pipettare con cautela 20 μl di ciascuna miscela campione/tampone di caricamento in pozzetti separati nel gel. 5. Pipetta 10 μl del DNA ladder standard in almeno un pozzetto di ciascuna riga sul gel. 4.7 Esecuzione del gel Eseguire l'elettroforesi a 60 V per 90 min, quindi visualizzare le bande di DNA utilizzando un illuminatore UV. Un esempio di gel di agarosio di elettroforesi su gel di poliplessi SPION/PEI/DNA a diversi rapporti N/P è mostrato in Fig. 5. Fig. 5 Elettroforesi su gel di agarosio di poliplessi SPION/PEI/DNA. Corsia N: DNA plasmidico (nudo). Le corsie 0,5-30 corrispondono a poliplessi SPION/PEI/DNA con diversi rapporti N/P 192 Fatin Nawwab Al-Deen et al. 5 Note 1. La soluzione PEI 10% (p/v) è la soluzione di lavoro del reagente PEI che dovrebbe essere stabile per un lungo periodo di tempo a 4 °C. Se è necessaria una soluzione al 6% di PEI, aggiungere 6 ml di 10% di PEI a 4 ml di H2O. 2. Per comodità, uno stock concentrato di tampone TAE (o 10× o 50×) viene spesso preparato in anticipo e diluito con acqua a concentrazione 1× prima dell'uso. 3. La presenza di citrato trisodico (C6H5N / A3oh7.2H2O) sulle nanoparticelle magnetiche funziona come stabilizzatore elettrostatico [15]. Il citrato trisodico ha tre gruppi carbossilici che ne favoriscono l'adsorbimento sulle particelle di ossido di ferro, mentre la ionizzazione dei gruppi carbossilici fornisce alle particelle magnetiche rivestite una carica negativa per dare una dispersione stabile in acqua a causa di una forte repulsione elettrostatica reciproca. Inoltre, queste particelle cariche negativamente sono in grado di adsorbire polielettroliti cationici come il PEI. 4. Un'elevata velocità di agitazione (1.500 rpm) potrebbe svolgere un ruolo efficace durante la nucleazione delle particelle nell'impedire ai nanocristalli di crescere ulteriormente in grandi cristalli singoli. Inoltre, la dimensione delle nanoparticelle diminuisce all'aumentare della velocità di agitazione a causa della crescente quantità di energia che viene trasferita alla sospensione. Le SPION con questo intervallo di dimensioni ristrette potrebbero essere utilizzate per la consegna del vettore genico perché è stato dimostrato che le piccole dimensioni delle nanoparticelle influenzano la velocità del loro assorbimento e la loro citotossicità [19]. 5. Assicurarsi che il rubinetto dell'imbuto di gocciolamento sia completamente chiuso per impedire l'avvio della reazione di coprecipitazione mentre il contenuto viene aggiunto al pallone a tre colli in questa fase. 6. Un condensatore è attaccato al pallone a tre colli riscaldato e l'acqua di raffreddamento viene fatta circolare per condensare il vapore, restituendolo al pallone come liquido. 7. Un agente di rivestimento altamente caricato positivamente per nanoparticelle magnetiche come il polimero cationico PEI presenta vantaggi rispetto ad altri policationi in quanto non solo aumenta le forze repulsive tra le particelle, ma si associa facilmente anche al DNA plasmidico caricato negativamente accompagnato da un'attività endosomolitica intrinseca [20]. 8. Il calcolo del rapporto N/P per i complessi SPION/PEI/DNA è definito come la relazione molare dei gruppi amminici primari nella molecola cationica PEI (secondaria e terziaria le ammine sono trascurate in questo calcolo a causa della loro minore p lowerKun valori), che rappresentano le cariche positive, al fosfato gruppi nel DNA, che rappresentano le cariche negative. Il Consegna di nanoparticelle superparamagnetiche del vaccino a DNA 193 il calcolo del rapporto N/P si è basato sul presupposto che un'unità ripetitiva di PEI contenente un azoto (N) corrisponda a 43,1 g/mol e un'unità ripetitiva di DNA contenente un gruppo fosfato (P) corrisponda a 330 g/ mole [21]. Ad esempio, se dobbiamo preparare SPION/PEI/DNA poly- plexi contenenti 10 μg DNA con rapporto N/P di 2: Per il DNA, 330 g / mol corrisponde a un atomo di fosfato. 1 μg×330 g/1 μg=1 mol fosfato. 1μg DNA = 1 mol fosfato × 10−6 / 330. 1μg DNA=3.03×10-9 moli di fosfato. 10μg DNA=10×3.03×10-9 moli di fosfato. 10μg DNA=30,3×10-9 moli di fosfato. Per PEI, il numero di atomi di N in 25 KDa di PEI=25.000/ 43,1=580,0464≈580.05. Se dobbiamo preparare poliplessi SPION/PEI/DNA con an Rapporto N/P di 2: N/P=2. N=2×P. N=2×30,3×10-9=60,6×10-9. (1 mol di PEI=580,05 mol di N.) Quante moli di PEI ci sono in 60,6×10-9 moli di N? 60,6×10−9/580,05=0,10×10-9 moli di PEI. Massa PEI=0,10×10-9 mol ×25.000 g/mol =2,61×10− 6 g=2.61 μg. In alternativa, possiamo utilizzare il rapporto per calcolare gli importi di PEI e DNA richiesti. Il rapporto g/mol per un N (PEI) su un P (DNA) è N:P=43.1:330. Per N / P = 2, il rapporto g / mol è 86,2: 330. Quindi, massa di PEI:massa di DNA=86,2:330. Per 10μg DNA, il rapporto diventa Massa di PEI:10 μg=86,2:330 o, sotto forma di divisione, Massa di PEI/10 μg=86,2/330. Riordino, massa di PEI=86,2/330×10μg=2.61 μg. Poiché in precedenza abbiamo rivestito SPION con PEI alla massa PEI/Fe rapporti di (R)=10 (vedere sottotitolo 3.2), la massa di SPION potrebbe essere calcolata in base alla massa di PEI, supponendo che tutte le SPION siano completamente rivestite con polimero PEI: R (10)=PEI/SPIONI. Massa di SPION = 2,61 μg/10=0.261 μg. 194 Fatin Nawwab Al-Deen et al. 9. EtBr è un agente intercalante comunemente usato come etichetta fluorescente (colorazione dell'acido nucleico) che si lega al DNA e consente la visualizzazione del DNA sotto la luce ultravioletta (UV). 10. I gel possono essere preparati diversi giorni prima dell'uso e sigillati in un involucro di plastica (senza pettini). Riferimenti 1. Krotz F, Sohn HY, Gloe T et al (2003) La 11. Boussif O, Lezoualch F, Zanta MA et al (1995) Un vettore magnetofezione potenzia la consegna versatile per il trasferimento di geni e oligonucleotidi genica alle cellule endoteliali in coltura. J nelle cellule e in-vivo-polietilenimina. Proc Natl Acad Vasc Ris 40: 425–434 Sci USA 92:7297–7301 2. Scherer F, Anton M, Schillinger U et al (2002) 12. Behr JP (1997) La spugna protonica: un trucco per Magnetofection: miglioramento e targeting della entrare nelle cellule che i virus non hanno sfruttato. consegna genica mediante forza magnetica in vitro e Chimia 51:34–36 in vivo. Gene Ther 9:102–109 13. 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