化学蛋白质组学简 介 基于化学 改性（ 探 针设计 ） 不基于化 学改性 化学蛋白质组学概况 配体 （如药物 ） 共价结合 靶蛋白 1 非共价结合 （ 后续无法检 测复合物？ ） 靶蛋白 2 共价结合 额外的反应性 基团（如 光激 活 基团）， 不 应改变活性 在特定波长光的照射下会产 生高活性自由基，促使活性分子 与靶 标共价结合。 连接链 疏水用烷基链 亲水用聚乙二醇链 报告或富集 基团 荧光基团 生物素 点击化学反应基团 探针基本结构 生物素 （ 为什么？） 又称维生素 B7 、维生素 H 或辅酶 R ，是一种水溶性 B 族维生素，在体内 用作羧基载体，缺乏可引起皮炎。 能与蛋白质通过肽键结合 • 鸡蛋不宜生吃？ • 生蛋清含量高的饮食会导致狗、猫、兔子和人类出现中毒症状，包括皮炎、脱 发和肌肉协调性丧失。 • 在生鸡蛋清中有一种 抗生物素蛋白能与生物素紧密结合 ，使其失去活性！ • 当年发现生物素的起因！ • 这种能与生物素紧密结合的蛋白有什么意义？ 抗生物素蛋白 （亲和素 ） • 生物素与亲和素（两个亚基） 之间 的 结合 • 目前已知强度最高的非共价作用之一 • 解离常数 K d 为 10 - 15 mol/L • 比抗原与抗体间的亲和力高 1 万倍以上！ • 链霉亲和素 （链霉菌分泌的亲和素 ）， 与鸡蛋清中的亲和素不同的是 其 不含 糖基 ，所以特异性更强 （ 不会与多糖 【尤其是细胞表面】发生非特异性结 合 ） ， 适用范围更广泛。 利用 链霉亲和素包被的磁珠 等固相介质对共价结合了 探针的靶标蛋白进行 富集 （ 可能存在蛋白质浓度达不到质 谱定量限的问题） ，然后用质谱检测识别靶标！ —— 亲和质谱（详见生物质谱概述 II ） 点击化学 • 用碳杂键 （ C-X-C ） 连接小单元结构产生新的 化合物结构 • 反应起始原料 易得 ，反应条件 温和简易 • 产率高 • 有立体 选择性 ，产品分离 简单 报告基团可选用 反应惰性、体积较小 的点 击化学反应基团，如 炔基 ，有利于使探针 保持配体原有的化学结构和生物学活性， 增加探针结合和标记靶蛋白的效率 ，捕捉 小分子配体的真实结合靶标。 NHS- 双吖丙啶 光激活基团 vs 铜催化的叠氮 - 炔环加成反应 可设计此类反应进行荧光基团等可 检测基团的标记或生物素 - 靶标富集 靶标鉴定 荧光基团 生物素 主 要 是 对 直 接 结 合 基 团 的 简 化 ， 降 低 空间位阻 点击化学反应基团 更多参考 ... ... SDS- PAGE 显影 可视化 配体在细胞内结合 靶蛋白的 空间定位 （不利于低丰度 ） 蛋白质微阵列（高通量 ） 富集后质谱鉴定蛋白 不设计探针？ —— 改变靶蛋白 （酶解、热处理、氧化等 ） 通过化学改性将药物等活性小分子固定化或衍生化可能因改变药物的化学结 构干扰小分子与其真实结合靶标之间的相互作用。为了解决这一问题，出现了多 种不依赖对目标分子进行化学改性的靶标发现方法。它们不需要对目标小分子进 行结构改造和衍生化，而是通过 监测小分子原始结构所影响的蛋白质的特定理化 性质 进行靶标筛选。 然而，这类方法所确定的靶标未必是活性分子的直接结合靶 标，因而两类方法具有很好的互补性 。 基于酶解稳定性 —— 药物亲和性反应靶标稳定性技术 D rug A ffinity R esponsive T arget S tability ， DARTS 切胶送检， 准确性有限 DARTS 的主要策略是将小分子药物与样品蛋白共孵育一定时间后，加入蛋 白酶进行消化， 由于小分子药物结合后可以保护靶蛋白使其对蛋白酶的敏感性降 低 ，所以电泳凝胶染色后，对比不加药物的消化组，找出受保护的条带，再通过 质谱技术就可鉴定出药物靶标蛋白。 颜色变深， 丰度增加 基于酶解稳定性 —— 限制性蛋白酶酶切技术 Limited Proteolysis ， LiP LiP 是基于 小分子结合蛋白后相对于原蛋白形成蛋白构象及位阻的变化，从而形成不同的 酶切位点 ，通过质谱检测这个差异来推测结合位点的技术。实验时先使用低浓度的 非选择性蛋 白酶 K 进行有限的蛋白水解，优先切割蛋白质暴露在外的柔性部分 （环或者未折叠部分） 。然 后经过变性和胰蛋白酶消化后，通过 LC-MS 分析肽混合物。因为胰蛋白酶只特异性地切割赖氨 酸或精氨酸位点的肽段，其它氨基酸位点的切割则是由蛋白酶 K 水解产生的半胰蛋白酶肽段。 药物处理细胞后，药物的靶标蛋白由于药物分子的结构发生改变从而避免了被蛋白酶 K 切割。 半胰蛋白酶水解肽段的丰度出现明显减少就可以认为是由于药物分子结合诱导的蛋白结构变化 产生的结果。 基于热稳定性 —— 细胞热迁移分析 Ce llular T hermal S hift A ssay ， CETSA CETSA 是一种检测细胞内药物与靶蛋白结合效率的实验，其原理是 靶蛋白与药 物分子结合时通常会变得稳定 。即随着温度的升高，蛋白会发生降解；当蛋白结合 药物后，相同温度下，未降解蛋白的量会提高， 该复合蛋白的热熔曲线会右移 。 基于热稳定性 —— 热蛋白质组分析 T hermal P roteome P rofiling , TPP TPP 技术通过测量在加热细胞和裂解物到一定温度范围后的蛋白质的 可溶性部 分 来确定整个蛋白质组的热稳定性。 基于蛋白质氧化速率稳定性 S tability of P roteins from R ates of Ox idation ， SPROX SPROX 是利用 配体诱导的蛋白质稳定性增强 的原理建立的，以蛋白质携带的甲 硫氨酸（ Met ） 残基被氧化的程度为指标。首先将蛋白质样品与药物或对照溶剂共 孵育，在浓 度 越来越高的化学变性剂（如盐酸胍） 的存在下加入 氧化剂 （ 如过氧 化氢） 氧化 甲硫氨酸 ，随后通过 加入过量甲硫氨酸淬灭氧化反应 ，胰酶消化成肽 段后进行 LC- MS/MS 定量分析变性剂浓度依赖的甲硫氨酸的氧化速率， 当以未氧化 和 氧化的含 Met 肽段的量为纵坐标，变性剂浓度为横坐标时，药物结合蛋白未氧化 和 氧化的含 Met 肽段的转变中点右移。 基于靶向响应可及性 T arget- r esponsive A ccessibility P rofiling ， TRAP TRAP 的主要原理是， 配体与靶蛋白结合后，由于空间位阻或变构效应， 导致靶蛋白对应区域的活性赖氨酸残基无法被共价标记 。