pg. 1 SENMURV MultiStar - 2 SARS - CoV - 2 RT - PCR Kit Cat - No. BONCOV - MS 2 2 00 P B دستورالعمل استفاده از کیت تشخیصی ویروس MultiStar - 2 SARS - CoV - 2 شرح کیت کیت حاضر به روش Real - time PCR و به صورت تک مرحله ای نه تنها قادر به تشخیص صحیح و اختصاصی ویروس SARS - CoV - 2 است، بلکه می تواند میزان پایین ویروس در افراد ناقل بدون علامت را شناسایي کند. این کیت در قالب یک پلتفرم مولتی پلکس شامل سه ست پرایمر و پروب طراحی شده است. این کیت قادر به تشخیص همزمان دو ژن RdRp و N ویروس به ترتیب با فلوروفورهای T exas Red و FAM و همچنین ژن Rnase P انسانی به عنوان کنترل داخلی با فلوروفور HEX است. کنترل داخلی معین دقت در پروسه استخراج و سمپلینگ بوده و هر گونه نتایج منفی کاذب را آشکار می سازد. عملکرد و ارزیابی فنی کیت تشخیصی ویروس SARS - CoV - 2 با روش RT - PCR اختصاصیت آنالیتیکال تمامی توالی طراحی این کیت با هدف شناسایی های گزارش شده از ویروس SARS - CoV - 2 با اختصاصیت بالا صورت گرفته است. پرایمرها و پروب های مختص ژن های N و RdRp به گونه ای طراحی شده است که دارای هیچگونه واکنش دهی متقاطع با دیگر ویروس های رایج خانواده کروناویریده که در انسان بیماری زایی می کنند نباشد. بعلاوه این کیت واکنش دهی متقاطع با دیگر پاتوژن های شایع عفونی تنفسی از جمله parainfluenza 1 - 4, Influenza A and B virus, adenovirus 3, respiratory syncytial virus A and B, Rhinovirus, Bocavirus, Metapneumovirus, Bat Alphacoronavirus 229E related virus, Enteroviruses Acinetobacter baumannii, Bordetella parapertussis, Bordetella pert ussis, Chlamydia pneumoniae, Haemo philus influenzae, Klebsiella pneumoniae, Legionella pneumophila, Moraxella catarrhalis, Mycoplasma pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens , Staphylococcus aureus, Stenotrophomonas maltophilia, Streptococc us pneumoniae , Mycobacterium abscessus, Mycobacterium avium, Mycobacterium bovis, Mycobacterium chelonae, Mycobacterium avium - intracellulare,Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium kansasii ندارد. میزان دقت در تشخیص نمونه های منفی تجاری صد درصد بوده که این مبین اختصاصیت کامل کیت برای ویروس SARS - CoV - 2 است. pg. 2 حد پایین تشخیص حد پایینی تشخیص این کیت برای ژن های ویروسی N و RdRp برابر با 300 کپی در 1 میلی لیتر از نمونه است. حساسیت و صحت برای تعیین حساسیت ، اختصاصیت کلینیکل و صحت 50 نمونه مثبت و 50 نمونه منفی در مقایسه با کیت مرجع تست شدند .از 50 نمونه مثبت 1 عدد منفی گزارش شد (منفی کاذب) و از 50 نمونه منفی 2 عدد مثبت گزارش شد . رفرانس : MM17 - A, Verification and Validation of Qualitative N ucleic Acid Tests FP TN FN TP 2 48 1 49 98 % Sensitivity 96 % Clinical Specificity 97 % Accuracy محدودیت های این روش تشخیصی و الزامات 1 نتایج حاصل از آزمایش این کیت تنها در کنار شواهد بالینی، برای تشخیص COVID - 19 مستند است. تشخیص قطعی و درمان بیماران باید بر اساس ترکیب نتیجه این آزمایش با نتایج آزمایش های دیگر و سابقه پزشکی و همچنین نحوه پاسخ دهی به درمان صورت گیرد. 2 نتایج منفی کاذب می توانند به دلیل نمونه گیری، استخراج RNA و یا انتقال نمونه نامناسب بوده و یا ا ز غلظت کم نمونه ناشی گردد. نگهداری نمونه ها در شرایط نامناسب و یا حضور مهارکننده های واکنش PCR در نمونه می تواند منجر به نتایج منفی کاذب گردد. 3 نتایج مثبت کاذب می تواند به دلیل آلودگی های ایجاد شده در حین پروسه آزمایش باشد. گراف تکثیر ژن N گراف تکثیر ژن RdRp pg. 3 4 تمامی مراحل آزمایش باید ب ر اساس اصول Good Laboratory Practice (GLP) توسط پرسنل آموزش دیده دارای پوشش حرفه ای و محافظ Personal Protective Equipment (PPE) انجام شود. آزمایش های بالینی بر نمونه های عفونی باید در هود کلاس دو (Class II Biological Safety Cabinet) در محیط BSL - 2 انجام شود محتویات کیت برای 200 تست با حجم l μ 20 Title Abbreviation Volume per Vial Number of Vials 4x CAPITAL Buffer B 1000 μ l 1 20x RTase RT 200 μ l 1 N/RdRp/RP P 6 00 μ l 1 Positive Control PTC 200 μ l 1 Nuclease - Free Water W 1200 μ l 1 • کلیه محتویات این کیت باید در دمای C o 20 - و در تاریکی نگهداری گردد. • نگهداری کیت در دمای چهار درجه سانتی گراد نباید بیشتر از یک ساعت باشد. • بیش از دو مرتبه منجمد و ذوب کردن کیت توصیه نمی گردد. نمونه گیری و استخراج RNA ویروسی 1 نمونه های سیستم تنفسی شامل ترشحات یا مایع حاصل از شست و شوی مربوط به انتهای بینی و حلق ، سوآب از انتهای بینی و حلق، مایع حاصل از شست و شوی ریه ها، ترشحات نای و خلط قابل قبول هستند. نمونه گیری باید بر اساس شرایط و نوع نمونه و مطابق با پروتکل های استاندارد صورت گیرد. انتقال نمونه ها باید در مجاورت با یخ صورت گیرد. 2 نمونه های جمع آوری شده را می توان بلافاصله مورد آزمایش قرار داد. در غیر این صورت برای نگهداری کوتاه مدت (تا سه ماه) و یا طولانی مدت، می توان نمونه ها را در دماهای به ترتیب C o 20 - و C o 70 - قرار داد. 3 از ذو ب و منجمد کردن مکرر نمونه پرهیز شود. pg. 4 4 از راهنمای کیت استخراج اسید نوکلئیک ویروسی برای استخراج RNA استفاده شود. RNA استخراج شده می تواند مستقیما برای آزمایش PCR استفاده شود. در غیر این صورت، می توان RNA ویروسی را در دمای C o 70 - نگهداری نمود. ذوب و منجمد کردن RNA بیش از یکبار پرهیز شود. 5 محصول حاضر با کیت های QIAamp Viral RNA (Qiagen) ، High Pure Viral RNA (Roche) و DNA/RNA Extraction/Purification (Bioer) سازگار است. انجام آزمایش 1 نمونه بیمار: از محتویات اسید نوکلئیک حاصل از استخراج RNA استفاده شود 2 کنترل منفی (NTC) : همواره یک نمونه کنترل منفی حاوی آب بجای نمونه استفاده شود 3 کنترل مثبت (PTC) : از کنترل مثبت کیت بجای نمونه در یک واکنش استفاده گردد. آماده سازی مخلوط واکنش (تمام مراحل بر روی رک یخ صورت گیرد!) در هنگام آماده سازی واکنش ها، از فضاهای جداگانه جهت افزودن مستر واکنش ( تمیز ) و نمونه های بیمار (آلوده) استفاده نمایید. و هرگز درب ویال کنترل مثبت را در فضای تمیز (محل آماده سازی مستر واکنش) باز نکنید. N تعداد واکنش ها بوده و شامل تعداد نمونه ها و کنترل های مثبت و منفی و مقداری میکس واکنش بیشتر با در نظر گرفتن خطای سمپلرهاست. محاسبه N به گونه زیر است. ✓ اگر تعداد نمونه ها شامل نمونه های کنترل (n) برابر 15 یا بیشتر باشد: N = n + 2 ✓ اگر تعداد نمونه ها شامل نمونه های کنترل (n) کمتر از 15 باشد: N = n + 1 بر اساس مقدار N و برای واکنش های با حجم نمونه 5 میکرولیتری ، مقادیر مشخصی از موارد زیر را اندازه گیری کرده و آماده و مخلوط نمایید. Volume Reagent 1 μ l 20x RTase 5 μ l 4x CAPITAL Buffer 3 μ l Primer/Probe Mix 6 μ l Nuclease - Free Water 15 μ l Final Volume pg. 5 اضافه کردن الگو پس از آماده سازی محلول ها و انتقال آن به تیوب های واکنش، ابتدا نمونه کنترل منفی ( NTC ) را آماده کنید. برای این کار، 5 میکرولیتر از آب بدون نوکلئاز را به تیوب مربوطه اضافه نمایید. پس از انتقال به منطقه کار با اسید نوکلئیک، 5 میکرولیتر از نمونه کنترل مثبت (PTC) و 5 میکرولیتر از نمونه های بیمار را به تیوب های مربوطه اضافه نمایید. سپس تیوب ها را در دستگاه ترمال سایکلر قرار داده و نمونه ها را نام گذاری کنید برنامه دهی به دستگاه این دستورالعمل برای دستگاه های ABI 7500 و MIC و Rotor - Gene توصیف شده است. دیگر دستگاه های Real Time PCR دارای کانال های FAM ، Orange و Yellow نیز مناسب برای استفاده از این کیت هستند. پس از تنظیم کردن دستگاه مطابق برنامه زیر، واکنش را راه اندازی کنید. در صورت استفاده از دستگاه ABI 7500 گزینه رنگ رفرنس داخلی (pa ssive reference) را حذف کنید. Temperature Hold Cycle cDNA Synthesis 50°C 2 0 min 1 Pre - Denaturation 95 °C 10 min 1 Denaturation 95 °C 10 sec 45 Annealing and Acquisition on Channel Green , Orange and yellow 55°C 40 sec pg. 6 نمونه گیری و استخراج RNA اگر تعداد نمونه ها شامل نمونه های کنترل (n) برابر 15 یا بیشتر باشد: N = n + 2 اگر تعداد نمونه ها شامل نمونه های کنترل (n) کمتر از 15 باشد: N = n + 1 تمامی مقادیر در N ضرب شوند قرار دادن میکروتیوب ها در دستگاه ریل تام و اجرای برنامه آنالیز نتایج افزودن PTC NTC 5 میکرولیتر PTC 1 میکرولیتر از 20x RTase 5 میکرولیتر 4x CAPITAL Buffer 3 میکرولیتر Primer/Probe Mix 6 میکرولیتر آب بدون نوکل ئاز 5 میکرولیتر آب 5 میکرولیتر نمونه توزیع مخلوط واکنش بین میکروتیوب ها pg. 7 تفسیر نتایج بر ا ساس دستور العمل ها و طبق جدول زیر نتایج را تفسیر نمایید. ✓ در دستگاه کوربت، گزینه slope correction را فعال نمایید ✓ در آنالیز منحنی های تکثیر، فقط منحنی های سیگموئیدی قابل قبول هستند (شکل مقابل – گراف های الف) گراف های خط صاف موید حضور RNA ویروسی نبوده و منفی تلقی می شوند (شکل مقابل – گراف های ب) ✓ کنترل منفی: نمونه NTC نباید در هیچ یک از کانال های FAM ، Yellow و Orange دارای Ct پایین تر از 40 باشد. در غیر این صورت واکنش فاقد اعتبار بوده و نیازمند تکرار است. ✓ کنترل مثبت: Ct کانال های FAM ، Yellow و Orange نمونه PTC باید کمتر از 3 0 باشد. در غیر این صورت واکنش فاقد اعتبار بوده و نیازمند تکرار است. ✓ مقادیر Ct ژن های N و RdRp کمتر از 40 مورد قبول بوده و مثبت تلقی می شوند. ✓ تست های با نتایج Invalid معتبر نبوده و نیاز به نمونه گیری مجدد و تکرار دارند. ✓ شناسایی Rnase P برای نمونه های مثبت غیر ضروری است و تیتر بالای ویروس می تواند منجر به کاهش یا عدم حضور سیگنال مرتبط با Rnase P در نمونه های مثبت گردد. pg. 8 جدول تفسیر نتایج Results Analysis Tests Rnase P (Yellow Channel) N (Green Channel) RdRp (Orange Channel) PTC + + + NTC - - - Invalid - - - Suspected to COVID - 19 * + Ct > 35 - COVID - 19 Detected - At Least One Positive COVID - 19 Detected + At Least One Positive COVID - 19 Not Detected + All Negative نشانه مفهموم نشانه مفهوم کنترل مثبت دور از نور و گرما تعداد تست تشخیص آزمایشگاهی کد کالا شماره بچ تولید شده تاریخ انقضا محدودیت دمایی آدرس مطالعه دستورالعمل ٭ برای آگاهی از روند سیر بیماری پیشنهاد می گردد در صورت مثبت شدن ژن N و منفی بودن RdRp 4 الی 5 روز بعد تست مجدد تکرار شود . تهران ، سعادت آباد ، میدان فرهنگ ، بلوار 24 متری سعادت آباد ،خیابان حیدر نیا (دوم شرقی) ، پلاک 9 تلفن های تماس پشتیبان فروش : 215 - 02122082120 پشتیبان فنی : 09301821601